操作程序

BDFACSCalibur流式细胞仪的操作规程

一、仪器开/关机程序

1、开机程序

1.1检查仪器鞘液桶和废液桶。

1.2打开流式细胞仪。

1.3气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

1.4打开电脑。

1.5等待机器预热5—10分钟后可开始实验。

2、关机程序

2.1用4ml10%漂白剂作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入2ml。

2.2将样品支撑架置于中位，以HIRUN 5分钟，使内管吸入2ml。

2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.3将样品换成蒸馏水重复1-2步,以HIRUN 10分钟。

2.5选择Standby模式5分钟。

2.6关闭电脑，再关掉仪器。

二、仪器校验和分析参数设置程序（FACSComp操作程序）

1、CaliBRITEBeads的准备

1.1在装有1ml鞘液的FALCON管加一滴充分混匀CaliBRITEBeads，并标上unlabeled；若配有双激光做四色，则须在unlabeled管中再加一滴APC-beads；

1.2在另一装有3ml鞘液的FALCON管加入unlabeled-、FITC-、PE-、PerCP-、和APC-beads（若做四色）各一滴，混匀，在管壁上标上mixed（PerCP不很稳定，最好在上机前加入）；

1.3避光放置，准备上机。

2、软件环境的设置

2.1从苹果菜单进入，选择FACSComp软件；

2.2在SignIn视窗中填入下列信息：操作者、机构、实验室主任（操作者是必须填入的，计算机将保存这些信息），点击Accept；

2.3进入SetUp视窗，在AssaySelection中，选择你需要的Assay：Lyse/Wash、Lyse/NoWash或HLA-B27Calib；在CaliBRITEBeadsLotIds中，根据每一种beads所对应的编码输入LotID；在AutomaticSavingOptions中，你可以选择自动保存或不保存SummaryReport，你可以通过单击Location来更改文件名以及保存的位置；最后在SetUp视窗的右下角点击Run。

3、Beads的检测

3.1将功能键放在RUN的位置，流速设成HI，将混匀的标有unlabeled的试管放在支撑架上，点击Start，开始调节PMT，如软件在unlabeled试管中测到APC-beads，则在PMT调节完后，马上进行时间延迟的调校；如果调试成功，会出现“TimeDelayCalibrationwassuccessful”，然后直接进入补偿视窗；如果调试不成功，你有5秒钟的时间决定是再试一次，还是重复开始的PMT调节，或是继续到下一步调节补偿；若你在5秒内还没有决定，软件自动进到补偿的视窗。如果你在时间调校失败的基础上继续补偿的调节，那么你所得到的FL3-%FL4和FL4-%FL3的值会有较大的变化；

3.2在支撑架上换成混匀的标有mixed试管，点击Start，开始调节补偿，补偿调试成功后，FACSComp自动进行灵敏度调试，点击Start，开始调试灵敏度；调试完成后，软件计算结果，并将所有的结果都保存于CalibFile或CalibFile.LNW中，同时给出SummaryReport；

3.3从支撑架上移走装有beads的试管，换上蒸馏水，并将功能键换成STANDBY。

三、仪器操作程序

1、抗体标记

1.1取FALCON管加对应荧光抗体，再加标本，涡漩振荡数秒；

1.2避光室温放置20分钟；

1.3加1×溶血素2ml，涡旋振荡数秒；

1.4避光室温放置15分钟；

1.5离心，1000rpm×5分钟、室温；

1.6弃上清后加2mlPBS，涡旋振荡数秒；

1.7离心，1000rpm×5分钟、室温；

1.8弃上清后加0.5mlPBS，准备上机。

以上为全血标本，如是细胞培养液则无需加溶血素，直接1.6-1.8操作；如是全血不洗标本则加定量的溶血素，避光室温放置15分钟后，直接上机。

2、流式细胞仪分析

2.1从苹果菜单进入，选择操作软件；

2.2顺序输入样本姓名，点击RunTests，得到分析结果。

四、维护保养

1、每日保养

1.1用4ml10%漂白剂作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入2ml。

1.2将样品支撑架置于中位，以HIRUN5分钟，使内管吸入2ml。

1.3将样品换成蒸馏水重复1-2步。

1.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

1.5选择Standby模式10分钟。

1.6关闭电脑，再关掉仪器。

2、每月保养

2.1将10%漂白剂装入鞘液桶。

2.2旁路鞘液过滤器,以防损害。

2.3将盛有3ml10%漂白剂的试管置于样品支架上,以HIRUN20-30分钟。

2.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤2.3