细胞生物学实验讲义
中南民族大学生命科学学院
实验教学中心
2006年2月
目 录
1.细胞生物学实验
2.实验一
细胞膜的通透性观察
3.实验二 植物细胞骨架的观察
4.实验三 线粒体的超活染色与观察
5.实验四 叶绿体的分离与观察
6.实验五 线粒体的分离与观察
7.实验六 酸性磷酸酶的显示方法
细胞生物学实验
细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向全院本科生进行讲授。
实验一 细胞膜的通透性观察
一、实验目的
1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
三、实验用品
(一) 材料 鸡血细胞
（二）器材 普通显微镜、普通离心机、扭力天平、10ml 试管、10ml 刻度离心管、试管架，2ml 注射器（无需针头）或5ml 移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。
（三）试剂
1．Alsever 溶液
葡萄糖
柠檬酸钠(Na
柠檬酸（C6H 6O7.H2O）
氯化钠
蒸馏水
100ml
调PH 至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置
2. 0.128 mol/L NaCl
溶液。
3． 0.05 mol/L NaCl
溶液。
4． 0.4 mol/L NaCl
溶液。
3. 0.128 mol/L NH4Cl
溶液。
4. 0.128 mol/L NH
5. 0.128 mol/L NaNO3溶液。
11. 蒸馏水。
四、实验操作
1．从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever’s 液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。
2. 使用前，取用Alsever’s 液保存的新鲜鸡血5ml ，
加入8ml 的0.128 mol/L 的NaCl 溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此3
次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。
3. 取11 支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。
五、观察结果
1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。
2. 如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。
3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。
六、实验建议
1. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。
2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；
3. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。
七、实验报告及作业
表4-1 各种溶液的溶血现象观察结果
编号 测试溶液
是否溶血 时间
分析原因
1 0.128 mol/L NaCl
2 0.05 mol/L NaCl
3 0.4 mol/L NaCl
4 0.128 mol/L NaNO3
5 0.128 mol/L NH4Cl
6 0.128 mol/L NH
7 0.32 mol/L 甘油
8 0.32 mol/L 乙醇
9 0.32 mol/L 丙酮
10 0.32 mol/L 葡萄糖
11 H2O
书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表4-1。
目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－
实验二 植物细胞骨架的观察
一、实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝R250 对植物细胞骨架染色的方法。
2. 通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。
二、实验原理
细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。
三、实验用品
(一)材料 洋葱
（二）器材
显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH 计
（三）试剂
0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3） 50ml
0.15mol/L NaCl
双蒸馏水加至1000ml
2. PB
0.2mol/L Na2HPO4 77ml
0.2mol/L NaH2PO4 23ml
3. M-缓冲液
咪唑(PH
6.7) 50mmol/L
KCl 50mmol/L
MgC12 0.5mmol/L
EGTA 1mmol/L
EDTA 0.1mmol/L
巯基乙醇
1mmol/L
甘油
4mmol/L
用1mol/L HCl 调pH 至7.2。
4. 1%的Triton X-100/M-缓冲液
甲醇
46.5ml
冰醋酸
7ml
蒸馏水
46.5ml
6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）
四、实验操作见图4-4
取洋葱内皮
置于含PBS 液的载玻片上
湿润后，吸去PBS
加2 滴1%Triton
X-100/M-缓冲液，5min
吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min
加PBS 洗2 次，共3min
加0.2%考马斯亮蓝R250 染色30min
用PBS 洗2 次，共2min，吸干
镜检并绘图
图4-4 细胞骨架标本制作过程
五、实验建议
1. 用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理材料时，应控制在30min 左右。
2. 每一次加液或染色后，应用PBS 洗2 次，并用滤纸吸干。
六、实验报告及作业
1. 画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。
2. 为什么用TritonX-100 的缓冲液处理材料？
实验三 线粒体的超活染色与观察
一、实验目的
1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
2. 学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
三、实验用品
（一）材料 肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
（二）器材 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
（三）试剂
1．Ringer 溶液
氯化钠
氯化钾
氯化钙
蒸馏水
100ml
2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）
称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）
取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。
四、实验操作
1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
(1) 取清洁载玻片放在
(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
(3) 在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染或蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。
2. 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察
(1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
(2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加詹纳绿B 应用液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体表面可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。
(3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴子载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
(4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l～2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
3. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察
(1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。
(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer
液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
(3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
五、实验报告及作业
绘制口腔上皮细胞、洋葱鳞茎表皮细胞、小白鼠肝细胞中线粒体的形态与分布。
实验四 叶绿体的分离与观察
一、实验目的
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解。
二、实验原理
将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
三、实验用品
(一) 材料 新鲜菠菜或其它植物叶片
（二）器材 普通离心机、组织捣碎机、扭力天平、光学显微镜、
（三）试剂 0.35mol/L NaCl 溶液。
四、实验操作
1. 游离叶绿体的制备与观察
（1） 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称
（2）利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。
（3）将匀浆液用200 目尼龙网或6 层纱布过滤，收集于
（4）取滤液
（5）将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。
（6）将沉淀用0.35mol/L NaCl
溶液悬浮。
（7）取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。
2. 组织中叶绿体的观察
取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。
五、观察结果
1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2. 表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈无色。
3. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。
4. 叶脉导管呈螺纹状。
5. 保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。
6. 气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。
六、实验建议
1. 植物组织匀浆后要悬浮在等渗介质中进行差速离心；同时叶绿体的分离最好在0～
2. 如用荧光显微镜观察叶绿体，则可以取一滴叶绿体悬液在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%
吖啶橙染液染色1min，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发出绿色荧光。
七、实验报告及作业
1. 画出分离后的细胞组分（注明形态的放大倍数）。
2. 分离细胞组分时，为什么要加入0.35mol/L 氯化钠？
实验五 线粒体的分离与观察
一、实验目的
1. 初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方法。
2. 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进行分离。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
三、实验用品
(一) 材料 小鼠12 只
（二）器材 冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙网、玻璃匀浆器、PH 计、高压灭菌锅等。
（三）试剂 氯化钠、詹纳斯绿B、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、甲醇、冰醋酸、双蒸水、甘油、姬姆萨染料、KH2P04 、Na2HP04。
1．0.9%灭菌的生理盐水。
2. 1%詹纳斯绿B 染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
0.1mol/L 盐酸8.4ml
加重蒸水到100ml
加蔗糖到0.25mol/L。
5. 固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)
6. 姬姆萨染液（原液）：Giemsa 粉
7. 姬姆萨染液（应用液）：临用时，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)作l0 倍稀释。
8. 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.8)：
l/15mol/L KH2P04 50ml
l/15 mol/L Na2HP04 50ml
四、实验操作
1. 制备小鼠肝细胞匀浆实验前小鼠空腹12h，拉颈处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织
2. 离心先将9ml 0.34mol/L 缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入9ml 肝匀匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按图图4-3 顺序进行差速离心。差速离心提取鼠肝线粒体流程见图4-3。
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴1 滴姬姆萨染液应用液染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。
(2) 线粒体取线粒体沉淀1 滴涂片，滴加1%詹纳斯绿B 染液染20min，覆上盖玻片，镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验建议
1. 注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。最好在在0～
2. 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3. 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
六、实验报告及作业
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～
2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质0.25mol/L 及0.34mol/L
缓冲蔗糖溶液哪一种在下层? 有什么作用?
取
先用生理盐水洗净血水，滤纸吸干，然后用预冷的
洁净的肝组织
剪碎，按1：9 用预冷的
鼠肝匀浆液
700×g 离心10min
沉淀
上清液
加10 ml 预冷的
每次1000×g 离心15min
沉淀
上清液
（细胞核及质膜碎片）
合并
10000×g 离心10min
离心
沉淀（线粒体） 上清液
加10ml 预冷的
每次10000×g 离心15min
沉淀
上清液
（纯化的线粒体）
图4-3 差速离心提取鼠肝线粒体流程图
实验六
酸性磷酸酶的显示方法
一、实验目的
1. 掌握Comori 法的基本原理和方法。
2. 观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。
二、实验原理
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基，在PH5.0 的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性璃酸酶在细胞内的存在与分布。
本实验的技术特点是：①用冷冻涂片和中性福尔马林固定，可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活，保证了实验的稳定性。②采用较短的作用时间，可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象，保证了实验的可靠性。③以姬姆萨染色的巨噬细胞为观察对象，细胞核及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰，有助于深入理解细胞吞噬作用、浴酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质。
三、实验用品
（一）材料小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)
（二）器材高压灭菌锅、冰箱、注射器、载玻片、盖玻片及温箱。
（三）试剂
1. 10%中性福尔马林(pH6.8～7.2)
甲醛
10ml
醋酸钠
蒸馏水
90ml
2. 酸性磷酸酶作用液
蒸馏水
90ml
0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml
5%硝酸铅
2ml
3.2%β-甘油磷酸钠
4ml
先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液，另—份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若PH＜5.0，可加少量醋酸调节。临用前配制。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀，否则将严重影响实验结果。
3. 1%硫胺溶液
硫化胺 1ml
蒸溜水
9ml
4. 姬姆萨染液(1:30)
姬姆萨原液
3 滴
磷酸盐缓冲液(PH6.8) 5ml
5. 3%淀粉肉汤
牛肉膏
蛋白胨
氯化钠
蒸馏水
100ml
高压灭菌9.9×104Pa(
解后，
四、实验操作
1. 取小白鼠1 只、每日腹腔注射6%淀粉肉汤
2. 第3 天注射后3～4h，脱颈处死小鼠，打开腹部皮肤，暴露腹膜，再向腹腔内注射生理盐水2ml，过3min 后在原注射部位抽取腹腔液0.1～0.2ml。
3. 将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每片1～2 滴。将玻片垂直插入玻片架，迅速放到冰箱内(
4. 30min 后，将玻片转入10%中性福尔马林，
5. 自来水漂洗5min，把水沥干。
6. 转入酸性磷酸酶作用液中，
7. 自来水漂洗片刻。
8. 1%硫化胺处理3～5 min。
9. 自来水冲洗，甩干。
10. 用1:30 的姬姆萨染液染色15min。
11. 自来水冲去染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜检。
12. 对照实验
将第3 步的腹腔液涂片置
步的同样实验。
五、实验结果
在巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和班块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富，整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。
六、实验报告及作业
1. 简述酸性磷酸酶显色的原理是什么？
2. 绘制一张实验所见的巨噬细胞中酸性磷酸酶显色图。